反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機溶劑的水溶液為流動相,根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣,RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面*被非極性基團所覆蓋,表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此,必須用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈等)或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。
反相色譜柱在使用前,醉好進行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照C4反相色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是醉佳條件),只有這樣,測得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
①醉好使用流動相溶解樣品。
?、谑褂妙A(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
?、凼褂?.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:
?、倭鲃酉鄬悠肪哂幸欢ǖ娜芙饽芰?,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
②流動相與樣品不產(chǎn)生化學反應(yīng)c、流動相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
?、哿鲃酉嗟奈锘再|(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,醉好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
?、芰鲃酉喾悬c不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實驗無法進行。
⑥在流動相配制好后,一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的C4反相色譜柱,要追求醉佳柱效,醉好使用醉佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的C4反相色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當選用醉佳流速時,分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時,可適當增加甲醇或乙腈的含量)。